复方银杏叶颗粒改善人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的作用及其机制研究(4)

　　3.3.2 复方银杏叶颗粒对Caspase-3活性的影响 H₂O₂干预后，内皮细胞中Caspase-3活性提高，药物预处理过的各组Caspase-3活性基本保持在较低水平，与模型组相比，均显著降低（P<0.01），见表2。H₂O₂处理后，内皮细胞凋亡明显，保护性复方银杏叶颗粒给药，能够有效的抑制细胞凋亡。
　　3.4 复方银杏叶颗粒对凋亡相关蛋白表达的影响
　　Western blot结果显示，模型组与对照组相比，Bcl-2表达明显降低，Bax表达明显提高。而不同质量浓度的复方银杏叶颗粒组与模型组相比，明显恢复Bcl- 2和Bax的正常表达，见图4。以上实验表明，复方银杏叶颗粒抑制内皮细胞凋亡，可能与调控Bcl-2和Bax蛋白，使其恢复正常水平有关。药物质量浓度与药效存在剂量依赖，640 mg·L^-1的复方银杏叶颗粒的药效优于其他质量浓度。
　　4 讨论
　　复方银杏叶颗粒中的主要有效成分为黄酮类和银杏内酯类化合物，它们能有效清除如H₂O₂诱导产生的自由基等，保护内皮细胞的正常生理功能，抑制细胞凋亡^[9]。血管内皮细胞氧化损伤、凋亡是As疾病进程中的关键步骤^[10]。H₂O₂（1 200 μmol·L）能明显抑制内皮细胞的活性，使用银杏叶提取物进行干预后，与模型组比较，内皮细胞活性和功能明显改善。药物质量浓度与药效存在较好的剂量依赖，640 mg·L^-1的复方银杏叶颗粒的药效优于其他质量浓度。
　　机体发生氧化应激损伤时，大量的生理指标均会随之发生变化。LDH释放量增加，是反应细胞损伤的一个较敏感指标。MDA通过反应细胞内脂质过氧化程度，间接反映出细胞损伤程度。SOD是平衡机体氧化与抗氧化的关键酶，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。SOD活性也是判断细胞损伤程度的相关指标。NO由内皮细胞中L-精氨酸在一氧化氮合酶作用下合成，能够抑制血管平滑肌细胞增殖，舒张血管^[11]。内皮细胞发生氧化损伤时，NO生成明显减少。ET-1主要由血管内皮细胞分泌，当内皮细胞损伤后，ET-1释放明显增多。本实验中，给药各组与模型组相比，LDH释放量明显降低、MDA含量下降、SOD活性明显提高、NO含量升高，ET-1也随之下降，初步证明复方银杏叶颗粒氧化应激损伤的内皮细胞具有保护作用。
　　氧化应激损伤同样会诱导细胞发生凋亡，在内皮细胞发生凋亡的过程中，磷脂酰丝氨酸（PS）翻转到细胞膜外与Annexin V特异性结合，碘化丙啶（PI）只能穿透凋亡晚期细胞和死细胞破损的细胞膜，与细胞核染色。借此，通过Annexin V/PI这一经典染色方法，区分凋亡细胞和其他细胞。本实验结果表明，H₂O₂可以明显诱导内皮细胞凋亡，药物预处理后的各组细胞凋亡数量与模型组相比明显减少，证明复方银杏叶颗粒能够在一定程度上抑制氧化应激诱导的细胞凋亡。
　　Caspase-3作为凋亡过程中关键的执行蛋白酶，与凋亡调控基因Bcl-2，Bax关系密切。Caspase-3是多种凋亡途径的共同下游效应部分，作用至关重要^[12]。而Bcl-2和Bax既能在上游调控Caspase-3活性，又能作为直接底物作用在Caspase-3下游。Bcl-2和Bax相互作用，形成特定的蛋白二聚体，对细胞凋亡具有重要的调控作用。H₂O₂能够使内皮细胞Caspase-3活性明显升高，Bcl-2表达上调，Bax表达下调，产生明显的细胞凋亡。给药后，以上3项指标基本恢复正常，证明复方银杏叶颗粒能够有效抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，进而保护内皮细胞。综上所述，复方银杏叶颗粒通过抑制细胞凋亡发挥其对氧化应激损伤的内皮细胞的保护作用。其机制可能与抑制Bcl-2蛋白表达，同时活化Bax蛋白有关，但具体信号通路并未阐明，尚需进一步探讨验证。

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